Microscopía de esporas, hifas, cistidios, tramas, para identificar hongos

Microscopio compuesto adecuado para estudiar hongos

La siguiente información es un extracto resumido del último libro de Pat O'Reilly, 'Fascinated by Fungi' . Para obtener detalles completos y páginas de muestra, consulte nuestra Librería, donde puede solicitar una copia firmada por el autor en línea ... (El libro también contiene un glosario de términos micológicos, y aquí tenemos una versión resumida para ayudar a los principiantes ...)

Microscopía y Fotomicografía

Cuando no pueda identificar un hongo en el campo, es posible que desee llevar una muestra a casa para estudiarla más a fondo. No tiene sentido hacerlo a menos que haya algo que pueda hacer en casa que no pueda hacer en el campo. La investigación microscópica es algo que se hace mejor en interiores cuando se tiene tiempo suficiente para hacer las cosas correctamente. A continuación, se ofrecen algunos consejos sobre cómo elegir y utilizar un microscopio para este fin.

Los microscopios de juguete están bien para observar estructuras de animales y plantas, pero para la micología realmente necesitas un buen microscopio. Esto se debe a que las estructuras finas de los hongos son muy pequeñas, algunas están cerca del límite de lo que se puede resolver con luz. Las longitudes de onda de los rayos X son mucho más cortas que las de las ondas de luz, y se pueden estudiar muchos más detalles utilizando microscopía de rayos X. Pero si cree que un microscopio óptico es una herramienta costosa para algo que para la mayoría de nosotros es solo un pasatiempo, ni siquiera considere volver a subcontratar su casa por un microscopio de rayos X de rango inferior.

Esporas de Lactarius azonites
Esporas de Lactarius azonites , vistas a través de una lente de microscopio de inmersión en aceite

Para estudiar esporas de hongos, basidios, cistidios, esferocistos y otras características diminutas de los hongos, necesitará un microscopio con un aumento de al menos x 400. Idealmente, opte por un microscopio con un aumento máximo de x 1000, pero para obtener imágenes razonablemente claras con un aumento tan alto, debe tener una lente de inmersión en aceite.

Las dimensiones y la ornamentación (verrugas espinosas, por ejemplo, ver imagen a la izquierda) de las esporas son características clave de identificación, y para que pueda medir las dimensiones de las cosas que está mirando, necesitará un ocular que tenga un micrómetro ocular o algún otro medios de calibración. Si encuentra confusas las instrucciones proporcionadas con el microscopio (o si tiene la suerte de obtener una ganga de segunda mano sin un manual), es casi seguro que alguien en su grupo local de hongos estará dispuesto a ayudarlo a configurar y calibrar su sistema.

Mi propio microscopio es trinocular, por lo que el adaptador de la cámara se puede utilizar incluso mientras miro a través de los oculares. (La mayor parte del tiempo simplemente observo la imagen que se transfiere a la pantalla de mi computadora).

Otras características del microscopio 'imprescindibles' incluyen:

  1. Iluminación ajustable, la mayoría de las veces directamente debajo de la diapositiva, y se denomina iluminación de campo claro. (Para los instrumentos biológicos, la iluminación de campo oscuro también es desde abajo, pero en un ángulo que asegura que la luz directa no ingrese al objetivo; requiere un condensador de campo oscuro especial o, para un aumento bajo, un tope negro insertado en la trayectoria de la luz).
  2. Perillas de control para mover la platina mecánica que sostiene la diapositiva
  3. Controles de enfoque fino y grueso

Productos químicos de tinción

Esferocistos en la estructura del tallo de Russula cyanoxantha, el quemador de carbón
Los esferocistos en la estructura del tallo de Russula cyanoxantha , un hongo del bosque comúnmente conocido como quemador de carbón, son responsables de su fragilidad. Esta imagen fue tomada con un microscopio con un aumento de x600. El material del tallo del portaobjetos se tiñó con rojo Congo.

La fina estructura de las esporas y muchas de las otras partes diminutas de los hongos que querrá observar bajo el microscopio son casi completamente translúcidas. Pueden verse claramente solo cuando se han manchado. Como ayuda adicional para la identificación, muchos hongos producen esporas que cambian de color cuando entran en contacto con ciertos químicos, denominados reactivos (debido a la reacción cuando las esporas entran en contacto con ellos). Estos son algunos de los productos químicos, tintes y reactivos más utilizados en microscopía micológica:

Agua destilada

(¡Sí, el viejo H2O!) Si desea ver sujetos pequeños y ver sus colores naturales, el agua es el agente humectante ideal. El agua del grifo contiene aditivos químicos que podrían limitar la vida útil de un tobogán, y el agua de lluvia es ácida e igualmente problemática, pero el agua destilada es barata y está fácilmente disponible. Es posible que deba agregar una gota de agente humectante fotográfico para evitar la distorsión de la imagen debido a las pequeñas burbujas de aire adheridas a las esporas u otro material sujeto. (¡El detergente líquido funciona!) Agregar aproximadamente un 10% de glicerina asegurará que los portaobjetos duren mucho más antes de secarse.

Amoniaco (NH3)

Este químico útil pero potencialmente peligroso emite un vapor extremadamente picante, por lo que la botella debe estar bien tapada en todo momento, excepto durante el uso. (El amoníaco doméstico de cualquier ferretería está bien). Además de un reactivo que causa cambios de color en algunos tipos de hongos, el amoníaco es un componente de ciertos otros reactivos. El amoníaco puro es un gas a temperatura ambiente normal y, para uso micológico, una solución al 10% en agua destilada es la concentración normal. Eso es fuerte y si entra en contacto con los ojos causará daños graves.

Sulfato ferroso (FeSO4)

Muchos aficionados a los hongos y micólogos llevan en su equipo de campo un cristal de sulfato ferroso, conocido coloquialmente como sales de hierro, para frotar en hongos (en particular, agallas quebradizas) para comprobar la reacción de color. No corra el gasto de comprar cristales de calidad farmacéutica; el material que se vende en los centros de jardinería para eliminar el musgo y para reducir la alcalinidad del suelo es muy barato (¡uy!) y funciona igual de bien.

Hidróxido de potasio (KOH)

Se utiliza tanto como medio de montaje (generalmente junto con un químico de tinción) como como reactivo, ya sea en el campo o en la base. Las superficies del sombrero o las branquias de algunos hongos cambian de color drásticamente cuando entran en contacto con KOH; pueden tornarse amarillos, rojos, magentas, oliva o negros, por ejemplo, según la especie. Por lo tanto, cuando hace un portaobjetos de microscopio con KOH, no solo se conserva contra la descomposición, sino que también puede provocar una reacción de color de diagnóstico que a veces puede contribuir tanto al proceso de identificación como los datos de tamaño y forma obtenidos a través del microscopio.

Reactivo de Melzer

Este cóctel de sustancias químicas es difícil de obtener porque uno de los componentes cruciales es la sustancia potencialmente peligrosa hidrato de cloral (una droga para la violación). Los otros componentes son fáciles de adquirir: cristales de yodo, yoduro de potasio y agua destilada. El yodo reacciona con sustancias con almidón para producir un color negro azulado intenso, y las esporas de hongos que contienen almidón se denominan "amiloide". Si se une a un grupo de hongos en el Reino Unido, es posible que pueda obtener el reactivo de Melzer a través de la Asociación de Grupos Británicos de Hongos (ABFG). Las esporas de especies de hongos pueden sufrir cambios de color de diagnóstico cuando se tiñen con el reactivo de Melzer. Las esporas se denominan:

  1. Amiloide si se vuelven de color negro azulado.
  2. Dextrinoide si adquieren un color marrón rojizo.
  3. Inamiloide (o negativo) si simplemente se vuelven amarillentos o no cambian en absoluto.

Estos términos se utilizan en guías de campo que enumeran los caracteres de las pruebas químicas para cada especie.

Manchas

Asci de Poronia punctata
Asci de Poronia punctata , Hongo de las uñas

Las principales razones para usar tintes al hacer portaobjetos de microscopio son:

  1. mejorar el contraste en una imagen microscópica
  2. resaltar estructuras de tejido particulares

A menudo, las manchas se utilizan junto con otros productos químicos que ayudan a prevenir la descomposición o la desecación del material en cuestión.

Ejemplos de agentes colorantes incluyen:

Rojo congo

Un excelente tinte de uso general para observar los detalles finos de las estructuras de las hifas (por ejemplo, ver la imagen del trama branquial de Amanita rubescens , a la derecha, donde las dimensiones marcadas están en micrones). Se presenta en forma de polvo y se disuelve mejor en un 10%. solucion de amoniaco.

Safranina

Otra tinción que produce núcleos de glóbulos rojos.

Lactofenol Algodón Azul

Esto mancha la quitina, lo que hace que estructuras como la ornamentación de esporas se vean mucho más claramente que con la mayoría de las otras manchas (incluido el rojo Congo).

Un disparo de despedida, bueno, este tiene más que ver con evitar partir. Los productos químicos mencionados anteriormente incluyen algunas sustancias muy cáusticas, ácidas y tóxicas, por lo que realmente deben almacenarse donde los niños no puedan agarrarlas. Los vapores del amoníaco, por ejemplo, pueden quemar los ojos; de hecho, algunas pruebas simplemente requieren que el vapor de amoníaco pase sobre el tejido fúngico para provocar un cambio de color.

Microscopio trinocular

Una caja fuerte segura podría salvar una vida. Tengo uno atornillado a la pared al lado del banco donde guardo mi microscopio (vea la imagen de arriba), y es ideal para almacenar productos químicos, hojas de afeitar, portaobjetos de vidrio, etc.

Esporas

Arriba: esporas del hongo de piel de naranja Aleuria aurantia

Hacer diapositivas

Las diapositivas más fáciles de hacer son las de esporas. (Aquí se muestran las esporas de Agaricus bisporus , el hongo botón comercial que siempre está disponible en las tiendas de abarrotes y supermercados). Todo lo que tiene que hacer es colocar el hongo, con el lado fértil hacia abajo, sobre un portaobjetos de microscopio y esperar una o dos horas.

A diferencia de cuando se intenta hacer una buena impresión de esporas, ni siquiera es necesario cubrir todo, aunque generalmente lo hago solo como recordatorio de que debajo hay un trozo de vidrio de bordes afilados. Debido a que desea poder ver esporas separadas en lugar de determinar el color de las esporas cuando se apilan capa tras capa, no necesita una impresión densa y, por lo tanto, no debe dejarla demasiado tiempo.

Una vez que tenga un poco de polvo de esporas en el portaobjetos, agregue una gota de agente humectante (¡agua con jabón servirá!) O un tinte adecuado si las esporas son claras en lugar de coloreadas, y coloque un cubreobjetos encima. El reactivo de Melzer es una buena elección porque al mismo tiempo que mejora el contraste, si sostienes el portaobjetos a contraluz podrás ver si las esporas son amiloides, dextrinoides o inamiloides, de lo cual hablaremos más adelante ....

Diapositiva - 1

Hacer diapositivas a partir de cortes muy finos de tejido fúngico es más difícil y debe esperar más fracasos que éxitos. La dificultad radica en crear un corte realmente delgado y uniforme que contenga las características que desea estudiar. En las branquias de una especie de agaricoide, es posible que desee estudiar los basidios, las extensiones de hifas (generalmente) en forma de maza sobre las que nacen los esterigmas y las esporas.

Una vez que haya cortado una astilla delgada con una hoja de afeitar afilada o arrancado una tira con un par de pinzas de punta de aguja, el proceso es el mismo que para los portaobjetos de esporas. Coloque su muestra en un portaobjetos, agregue unas gotas de tinte y luego un cubreobjetos, aplicando una ligera presión para aplanar la sección. Sea amable: la mayoría de los cubreobjetos tienen un grosor de poco más de una décima de milímetro y se rompen con mucha facilidad. Elimine cualquier exceso de mancha con un pañuelo absorbente y luego espere unos minutos hasta que la mancha haya penetrado en la muestra.

Diapositiva - 2

Una variación de este enfoque, bastante más fácil pero más una técnica de acertar y fallar, es aplastar una muestra bastante delgada entre dos diapositivas; con suerte, los trozos que le interesan saldrán por uno de los bordes. Use el tinte como antes para resaltar estas características de los bordes.

Al estudiar basidiomicetos bajo un microscopio, no se limita al tamaño y la forma de las esporas. También puede investigar varios tipos de cistidios. Estas son estructuras de hifas que se destacan de varias superficies. Dependiendo de dónde ocurran, se les da un nombre diferente: los pleurocistidios se encuentran en las caras branquiales, los queilocistidios son los que se encuentran en los bordes de las branquias, los pileocistidios se encuentran en la superficie del sombrero y los caulocistidios son los que se encuentran en el tallo del hongo. Las formas de los cistidios en cada una de estas ubicaciones pueden ser diferentes, y estas diferencias pueden ayudarlo a, er ... diferenciar entre especies.

Gill trama de Hygrocybe chlorophana

La microfotografía que se muestra arriba es del trama branquial de Hygrocybe chlorophana , el Waxcap dorado. No todas las cápsulas de cera pueden identificarse a nivel de especie mediante el examen de caracteres macroscópicos. Algunos se determinan mejor examinándolos al microscopio, mientras que algunos necesitan un examen tanto macroscópico como microscópico. Aplastar una pequeña pieza de material branquial (trama branquial) entre un portaobjetos y un cubreobjetos le permite estudiar la estructura del tejido. Algunos tienen hifas entretejidas; algunos son regulares (hifas que se encuentran paralelas entre sí) y otros son subregulares (en algún lugar entre los dos). Las células largas de Hygrocybe chlorophana son claramente visibles aquí, mientras que las células hifas de, por ejemplo, Hygrocybe miniata , Vermillion Waxcap) son mucho más cortas.

Software para hacer que la fotografía con microscopio sea menos dolorosa

Si alguna vez ha intentado tomar una fotografía de esporas u otros fragmentos de tejido fúngico bajo un microscopio, sabrá lo difícil que es enfocar todo. Obtienes una parte nítida y el resto se difumina. El problema se debe a la profundidad de campo muy limitada disponible con gran aumento. Un software especializado pero económico puede acudir en su ayuda. Toma varias imágenes enfocadas a diferentes profundidades en la muestra de tejido y el software construye una imagen usando las partes enfocadas de sus diversas imágenes. La medición de las esporas de hongos se hace mucho más fácil con un programa llamado Mycocam4. Producido por el micólogo Richard Shotbolt, está disponible como descarga gratuita en www.shotbolt.com y es muy sencillo de usar.

La microscopía es un tema especializado y no algo en lo que todos los interesados ​​en hongos quieran involucrarse. Para mucha más información sobre este tema, hay textos especializados, y para obtener ayuda para elegir y configurar un microscopio, los sitios web de proveedores independientes confiables como Brunel Los microscopios son un buen punto de partida. Por lo general, es posible concertar una visita para analizar sus necesidades específicas y probar algunas alternativas.

Ejemplos

En muchas de nuestras páginas de especies de hongos, verá ejemplos de fotografías de esporas tomadas con un microscopio con una cámara digital adjunta. Por ejemplo, vea Laccaria bicolor , que tiene interesantes ornamentaciones de esporas; y Cuphophyllus pratensis , que tiene esporas elipsoides o en forma de lágrima a subglobosas.


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